免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，是免疫學(xué)常用工具，主要應(yīng)用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB實(shí)驗(yàn)是先通過進(jìn)行跑電泳后，然后將分離好的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，再利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測樣品，常用于定性和半定量。
圖｜ WB實(shí)驗(yàn)流程圖
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WB實(shí)驗(yàn)常見十問
1、細(xì)胞水平做WB，一般多少數(shù)量細(xì)胞提的蛋白夠做WB？做組織樣品的WB的時候,怎樣處理樣品？
答：一般5×10^6就足夠了；特殊情況需根據(jù)自己的研究來確定。
必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫)，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分(12000轉(zhuǎn)/min，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白變性后可以存放多久？
答：-80℃，若沒有反復(fù)取出凍融，保存一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的WB檢測嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品；有時如果抗體特異性高且效價高，同時使用2種一抗，可在一張膜上檢測2種不同蛋白。
4、上樣超載多少會對實(shí)驗(yàn)有影響？可以用什么方法來增加上樣量？
答：正常超載30％不會有問題的，但不建議超載加樣。
可以濃縮樣品，或者根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白，還可以考慮加大膠的厚度，以增大上樣孔體積，比如嘗試1.5mm厚的膠。
5、我所測定的蛋白分子量是100KD左右，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會發(fā)生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預(yù)混膠、預(yù)制膠，詳情請參考“關(guān)于蛋白電泳那些事")
6、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
答：WB一般上樣30-100μg不等，結(jié)果跟目的蛋白的表達(dá)豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時間都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。
最開始摸條件時，各個步驟都可以量多一點(diǎn)時間長一點(diǎn)(背景也容易就出來了)。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)測試。
7、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？
答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持冰浴，保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明必須使用特殊方法，一般來說沒有區(qū)別。
8、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜表現(xiàn)不是很好？
答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移很慢，你延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡(轉(zhuǎn)過的表現(xiàn))。注意一點(diǎn)：麗春紅染色較好，不是你的目標(biāo)蛋白成功轉(zhuǎn)移至膜上的標(biāo)準(zhǔn)，只能作為一個粗略參考。
9、做半定量WB，內(nèi)參β-actin，GAPDH哪個好？
答：一般選用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。
10、請問一下PVDF膜和NC膜的區(qū)別是什么？為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，有疏水作用但相對較弱，和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。
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