取A液和B液一定要用不同的槍頭，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫放置數(shù)小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上（推薦150μl發(fā)光液/cm2膜），使之充分接觸。室溫孵育5分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。

    在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白條帶面向上。在黑暗中將X感光膠片放置在包裹的保鮮膜上，根據(jù)蛋白濃度曝光適當(dāng)時(shí)間（根據(jù)光強(qiáng)度需摸索曝光時(shí)間，一般30s-2min），顯影沖洗。注：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果背景過高，可使用兩張X感光膠片同時(shí)壓片。

    ecL化學(xué)發(fā)光液的注意事項(xiàng)，步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時(shí)間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。長時(shí)間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導(dǎo)致失敗。某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì)淬滅熒光，應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。